Gli obbiettivi,
le attività

Preparazione dell’inoculo micorrizico
Gli inoculi di funghi micorrizici arbuscolari (AMF) autoctoni toscani che saranno utilizzati nell’ambito del presente progetto sono stati isolati nei laboratori di Microbiologia Agraria del DISAAA-a UNIPI dai suoli della Riserva della Biosfera UNESCO Selve costiere di Toscana, in un sito particolare, tutelato all’interno del CiRAA – Centro di Ricerche Agro-Ambientali “Enrico Avanzi”, Università di Pisa, denominato “Riserva della Biodiversità dei Funghi Micorrizici”.

La Riserva è considerata uno degli “hot spot” mondiali di biodiversità di questi simbionti (Njeru et al., Biol Fertil Soils (2015) 51 :151-166 DOI 10.1007/s00374-014-0958-z). La grande biodiversità di questo sito è dovuta al fatto che è rimasto incolto per molti anni e al particolare ambiente mediterraneo, dove coesistono specie caratteristiche di climi temperati e sub-tropicali.

Il materiale biologico costituito da radici micorrizate, micelio e spore dei suddetti isolati di funghi micorrizici arbuscolari, sarà moltiplicato in colture in vaso (pot-culture) fino ad ottenere un buon livello di potenziale di inoculo micorrizico. Durante la coltura degli AMF dovrà essere eseguito un monitoraggio dell’attività dell’inoculo tramite la determinazione del potenziale di inoculo micorrizico (MIP) e grado di colonizzazione radicale delle piante utilizzate per la moltiplicazione dell’inoculo. Inoltre, per determinare la qualità dell’inoculo prodotto, ed escludere la presenza di contaminanti, dovrà essere eseguita la caratterizzazione molecolare (DNA) del microbiota fungino micorrizico, tramite primers specifici per i Glomeromycota relativi alla regione variabile V3-V4 del gene 18S rRNA. L’utilizzo dell’inoculo AMF autoctono toscano (Formulazione 2) sarà effettuato in associazione con le colture di copertura utilizzate come piante donatrici nella prova sperimentale in vigneto.

Lo scopo del presente progetto sarà quello di verificare la possibilità di arricchire il microbiota del suolo di due vigneti combinando due strategie differenti: (1) impiegare appositi preparati contenenti micorrize da distribuire nel suolo, (2) seminare colture di copertura interfilare capaci di promuove la proliferazione delle comunità micorriziche.

Come pianta donatrice sarà utilizzato un mix di sementi. e saranno testati per l’inoculo delle micorrize due preparati differenti, un preparato commerciale (RIZOTECH PLUS GLOMUS + BACILLUS SPP. Of Msbiotech) e un preparato realizzato e fornito dall’Università di Pisa che contiene micorrize dell’areale Toscano.
In occasione del primo anno di attività del progetto, la porzione di vigna di ciascuna azienda su cui sarà svolta l’attività dovrà essere suddivisa in due blocchi composti da dodici filari ciascuno, preferibilmente adiacenti. Ogni blocco sarà suddiviso in quattro appezzamenti, costituiti da 3 filari di vigneto. Quindi, le tesi realizzate nei 4 appezzamenti di entrambi i blocchi saranno: il controllo negativo (“C-“) cioè i filari senza pianta donatrice, il controllo positivo (“C+”) cioè i filari con pianta donatrice non inoculata, i filari con pianta donatrice inoculata con il preparato commerciale RIZOTECH PLUS GLOMUS + BACILLUS SPP. Of Msbiotech (Formulazione 1), i filari con pianta donatrice inoculata con un preparato realizzato e fornito dall’Università di Pisa che contiene micorrize dell’areale Toscano (Formulazione 2).
Il secondo anno di progetto invece saranno prese in esame solo due tesi: il controllo negativo (“C-“: vite senza pianta donatrice) e il controllo positivo (“C+”: vite con pianta donatrice non inoculata). In questo modo sarà possibile verificare se l’uso dei due preparati il primo anno di progetto abbia o meno favorito l’instaurarsi di una popolazione di micorrize stanziale.

Metagenomica su campioni di suolo.

Primo anno.

Al termine del primo anno per ciascuna delle 4 tesi allestite nelle 2 aziende saranno analizzati 3 campioni di suolo (1 campione per ciascun filare) in duplicato per blocchi per un totale di 48 campioni. Saranno utilizzati metodi di nuova generazione per la valutazione delle comunità fungine nelle differenti tesi utilizzando un approccio di metagenomica targeted.

Dai campioni di suolo verrà estratto il DNA usando un apposito kit commerciale. La quantità e la qualità del DNA estratto saranno valutate tramite un saggio spettrofotometrico. Un test preliminare di amplificazione a diverse concentrazioni sarà effettuato per verificare l’assenza di inibizione. L’ITS (Internal Transcribed Spacer) sarà amplificato tramite reazione a catena della polimerasi (PCR) usando dei primers universali e saranno preparate le librerie per il sequenziamento, che sarà effettuato tramite piattaforma Illumina MiSeq. L’elaborazione bioinformatica delle sequenze ottenute sarà effettuata tramite USEARCH (Edgar R.C., (2010). Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics 26(19), 2460-2461) o tramite DADA2 (Callahan B.J., P.J. McMurdie, M.J. Rosen, A.W. Han, A.J.A. Johnson, S.P. Holmes, (2016). DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods, 13, 581–583). L’assegnazione tassonomica sarà effettuata confrontando le sequenze rappresentative con le sequenze contenute in un database di riferimento. I dati tassonomici saranno utilizzati per calcolare le abbondanze relative delle popolazioni fungine presenti e saranno calcolati degli indici di biodiversità (es. Dice e Bray Curtis).

Saranno inoltre eseguite analisi statistiche multivariate (Hammer O., D.A.T. Harper, P.D. Ryan, (2001). PAST: Paleontological Statistics software packages for education and data analysis. Palaeontologia Electronica, 4(1), art4:9pp.) per individuare l’eventuale correlazione di specifiche popolazioni fungine alle condizioni testate.

Secondo anno.

La stessa attività sarà svolta il secondo anno, saranno quindi analizzati 48 campioni.

Monitoraggio del MIP dei suoli

Gli stessi campioni di suolo utilizzati per l’analisi metagenomica saranno analizzati per valutare il potenziale di inoculo micorrizico a seguito dei diversi trattamenti. Questa analisi sarà effettuata anche su campioni di suolo prelevati prima dell’allestimento della prova sperimentale.
Il saggio biologico MIP, eseguito per verificare l’attività dei propaguli degli AMF presenti nei campioni di suolo dei vigneti sottoposti a diversi trattamenti, sarà valutato utilizzando Cichorium intybus L. come pianta ospite. Dopo quattro settimane di coltura in cella climatica le radici delle piante test saranno sottoposte a colorazione differenziale per valutare la percentuale di colonizzazione micorrizica mediante il metodo gridline intersect (Giovannetti e Mosse, 1980).

Analisi delle caratteristiche tecnologiche delle uve

Primo anno

Per ciascuna delle 4 tesi allestite nelle 2 aziende saranno analizzati 2 campioni di uve prelevate al momento della vendemmia per un totale di 16 campioni. Il campionamento delle uve sarà eseguito in modo da essere rappresentativo delle diverse tesi e precisamente dal filare centrale di ciascuna tesi saranno individuati un numero significativo di grappoli distribuiti su tutta la lunghezza del filare. Da ciascuno di questi grappoli saranno prelevati da 3 a 5 acini avendo cura di sceglierli ad altezze diverse e con esposizioni al sole differenti. Ogni campione dovrà essere costituito da 500- 600g di uva.
Le uve saranno poi portate in laboratorio e immediatamente analizzate mediante HPLC per quantificare i seguenti metaboliti: glucosio, fruttosio, acido malico, il profilo fenolico (identificazione e quantificazione di circa 30 composti) e il profilo antocianinico (identificazione e quantificazione di circa 10 composti). La definizione dei profili fenolici e antocianinici richiederà, prima dell’analisi mediante HPLC, un adeguato protocollo di estrazione. Saranno poi presi in esame l’acidità totale (determinata mediante titolazione), l’azoto prontamente assimilabile (azoto amminoacidico totale e l’azoto ammoniacale), che sarà quantificato con metodiche spettrofotometriche, il pH ed infine il peso medio degli acini. Tutte le determinazioni saranno eseguite in doppio e i risultati saranno forniti come media e deviazione standard delle due rilevazioni. Infine, i dati saranno elaborati statisticamente (analisi della varianza) per valutare eventuali differenze tra le diverse tesi.
Le stesse uve saranno poi analizzate microbiologicamente secondo quanto riportato al punto A.4.2.

Secondo anno

La stessa attività sarà svolta il secondo anno anche se le tesi sperimentali passeranno da 4 a 2 per ciascuna azienda secondo quanto riportato nella sezione A.2, riducendo così il numero di campioni di uva a 8.

Analisi microbiologica delle uve
Primo e secondo anno

I campioni di uva presi in esame al punto 4.1 saranno analizzati microbiologicamente per descrivere il microbiota delle uve al momento della vendemmia. Più in dettaglio, dopo opportune diluizioni decimali in soluzione fisiologica, i campioni saranno seminati su piastre contenenti mezzi selettivi e differenziali per lieviti (WL agar con inibitori per muffe e batteri), batteri lattici (MRS agar in anaerobiosi), lieviti non-Saccharomyces (AL agar), muffe (PD Agar), batteri acetici (LF Agar). Tutte le piastre saranno incubate in termostato per 3-7 giorni a 30°C trascorsi i quali le colonie sviluppate saranno contate e sarà fornito il dato in UFC/g di uve. I microrganismi di interesse enologico saranno identificati a livello di specie mediante metodiche molecolari. Più in dettaglio, il metodo impiegato per identificare a livello di specie gli isolati di lievito sarà l’RFLP dell’rITS che prevede l’amplificazione della regione ITS del rDNA utilizzando primer universali, la successiva digestione dei prodotti di amplificazione con enzimi di restrizione e la corsa elettroforetica su gel di agarosio contenente un apposito colorante che si lega al DNA rendendolo visibile quando colpito da raggi UV. Al termine della corsa elettroforetica il gel illuminato con una lampada UV sarà fotografato con l’apposita telecamera e l’immagine sarà acquisita da un software dedicato di immagini. I profili di restrizione ottenuti saranno confrontati con quelli presenti nel Database del DAGRI per attribuire l’appartenenza dell’isolato alla specie. Per gli isolati di lievito i cui profili di restrizione non siano presenti nel Database, saranno amplificate e sequenziate le regioni D1/D2. I batteri invece saranno identificati mediante sequenziamento del gene 16S rDNA. Al termine dell’attività sarà possibile valutare l’impatto che hanno avuto le 4 tesi sulla microbiologia del grappolo. I dati ottenuti saranno messi in relazione con quelli ottenuti dalle precedenti azioni.

Allestimento delle microvinificazioni in rosso

Primo anno

Con il mosto ottenuto dalle uve di ciascuna tesi saranno allestite microvinificazioni in rosso in appositi contenitori da 10 L. In totale quindi saranno allestite 8 microvinificazioni per ciascuna Azienda, per un totale di 16, che saranno inoculate con un unico ceppo commerciale di Saccharomyces cerevisiae in modo da standardizzare il più possibile il processo fermentativo. Lo starter sarà inoculato alla concentrazione prevista dalle istruzioni d’uso del preparato. Da ciascuna microvinificazione saranno prelevati giornalmente i volumi di mosto/vino da sottoporre ad analisi microbiologiche (A5.2) e chimiche (A5.3). Al termine della fermentazione alcolica il vino sarà stabilizzato in condizioni di refrigerazione.
Secondo anno. Sarà ripetuta esattamente l’attività del primo anno, ma su 4 microvinificazioni (una per ciascuna delle tesi previste il secondo anno dal progetto) allestite per ciascuna Azienda, per un totale dunque di 8.

Analisi microbiologiche e verifica della dominanza del ceppo inoculato

Primo e secondo anno
Analisi microbiologiche saranno svolte al fine di descrivere le cinetiche di crescita del ceppo starter di S. cerevisiae inoculato al momento dell’allestimento delle varie microvinificazioni. Più in dettaglio, dopo opportune diluizioni decimali in soluzione fisiologica, i campioni di mosto/vino prelevati quasi giornalmente saranno seminati su WL agar. I dati in UFC/mL ottenuti saranno impiegati per costruire le curve di crescita che saranno analizzate con l’equazione di Gompertz (tramite software Graphpad Prism) per ricavare fase lag, massima velocità di crescita e rendimento di crescita. I parametri di crescita così ottenuti per ciascuna microvinificazione saranno confrontati statisticamente tra loro (analisi della varianza) per verificare una eventuale differenza tra i vari mosti nel supportare la crescita di un ceppo di S. cerevisiae commerciale. Analisi molecolari saranno eseguite per verificare l’effettiva dominanza del ceppo inoculato. In particolare, un numero significativo di isolati, prelevati quando la fermentazione alcolica avrà raggiunto i ¾ degli zuccheri degradati, sarà caratterizzato mediante amplificazione (PCR end point) delle regioni interdelta del DNA. I profili ottenuti dalla corsa elettroforetica degli ampliconi saranno confrontati con quello dello starter inizialmente inoculato. È importante prendere in esame questo aspetto in quanto se fossero presenti profili diversi da quelli del ceppo inoculato significherebbe che ceppi indigeni sono riusciti a prendere il sopravvento rendendo più complessa l’interpretazione del risultato finale e in particolare la comprensione del ruolo svolto dalla qualità delle uve nel definire il decorso delle fermentazioni. Infine, sempre per lo stesso motivo, in tre-quattro punti del processo fermentativo saranno quantificati anche batteri lattici (MRS agar in anaerobiosi), lieviti non-Saccharomyces (AL agar) e batteri acetici (LF Agar).

Analisi chimiche

Primo e secondo anno

Gli stessi campioni analizzati microbiologicamente saranno analizzati chimicamente per quantificare substrati e prodotti del metabolismo microbico. I principali parametri presi in esame saranno glucosio, fruttosio, etanolo, acidi organici (acido acetico, lattico, malico), glicerina, acidità volatile, solforosa, azoto prontamente assimilabile (azoto amminoacidico totale e l’azoto ammoniacale). I risultati analitici saranno forniti combinando i risultati analitici ottenuti con l’HPLC e quelli ottenuti invece per via enzimatica allo scopo di incrementare la precisione analitica nella quantificazione di alcuni composti. L’analisi enzimatica sarà condotta utilizzando l’analizzatore Hyperlab plus, uno strumento che ottimizza e rende più efficienti queste tipologie di analisi. Tutti i campioni saranno analizzati in doppio e il dato sarà fornito come media e deviazione standard delle due determinazioni. I dati saranno poi utilizzati per costruire cinetiche di produzione o degradazione dei vari composti che saranno messe in relazione con le informazioni ottenute dalle analisi microbiologiche. Tutte le analisi saranno condotte in doppio.
Sugli svinati saranno determinati anche i profili antocianinici e polifenolici mediante analisi HPLC e il colore (intensità e tonalità) mediante analisi spettrofotometriche classiche.
Infine, analisi statistiche (analisi della varianza) saranno svolte per valutare la presenza di eventuali differenze significative tra i dati chimici ottenuti dalle varie tesi sperimentali.

Per la caratterizzazione sensoriale dei vini ottenuti il primo e il secondo anno, sarà convocata una riunione composta dal personale delle due cantine, del DAGRI e di FoodMicroTeam. Queste persone utilizzeranno una scheda (messa a punto appositamente e ispirata a schede OIV) e ai degustatori sarà fornita la spiegazione dei seguenti descrittori (che possono essere utilizzati in scala da 1 a 5):
– Limpidezza: misura della torbidità. Questo descrittore consente di valutare l’intensità della torbidità del vino.
Aspetto: valutazione dell’intero spettro delle proprietà visibili di un prodotto. Questo descrittore valuta l’intensità, il colore principale del prodotto, le sue sfumature (colori secondari), la sua viscosità (non tenendo conto della sua limpidezza).
– Franchezza: valutazione del grado di sensazione percepita, al naso o al gusto, di un difetto del prodotto. Questo descrittore consente al degustatore di valutare la pulizia del vino. Nel penalizzare la genuinità, l’assaggiatore dovrà essere in grado di identificare i difetti che percepisce al naso o al gusto. Allo stesso modo si classifica l’intensità del sapore che si percepisce dopo aver messo in bocca il campione.
– Intensità aromatica: Grado (magnitudo) della gamma di odori positivi percepiti al naso e al gusto. Questo descrittore permette di valutare l’influenza dello spettro delle percezioni olfattive e gustative che contribuiscono a migliorare la percezione qualitativa percepita al naso e al gusto. Allo stesso modo si classifica l’intensità del sapore che si percepisce dopo aver messo in bocca il campione.
– Impressione generale (giudizio generale): corrisponde alla valutazione globale di un prodotto. Questo descrittore consente al degustatore di esprimere l’impressione che il prodotto lascia complessivamente. Questo dà la possibilità di una classificazione alta o bassa. Secondo le informazioni fornite agli assaggiatori, questo descrittore permette anche l’analisi della difficile questione della tipicità.
I dati ottenuti saranno elaborati statisticamente mediante analisi delle componenti principali.